同志諮詢熱線草創於1998年，起因於同志運動者見到青少年同志自殺的新聞報導，有感於青年同志的無助，希望成立一個固定、長期、專為青少年等弱勢同志服務的機構。在「同志助人者協會」、「Queer & Class」、「同志公民行動陣線」及「教師同盟」四個團體，與其他熱心的朋友，遂共同發起並成立了「同志諮詢熱線」。同年6月26日，第一屆晚會在臺大學生活動中心舉辦，隔天，熱線正式開始接線服務。
歷屆熱線募款晚會都在臺北舉辦，每每吸引上千名同志到場欣賞表演，並且於現場捐款。熱線服務對象，包括女男同志、雙性戀同志、跨性別同志、同志父母、學校老師與教育輔導工作者，提供他們有關於性傾向、情感關係、同志人權、愛滋健康等諮詢。
2000年6月9日，經正式向內政部社會司立案，熱線成為全臺第一個全國性同志組織，全名為「社團法人臺灣同志諮詢熱線協會」。熱線重點工作為，同志同儕輔導、同志支援網路、同志社區中心及同志人權教育。每年招募義工，並提供義工訊練課程；此外，也逐步發展「社群組織」、「同志人權」、「性別教育」、「愛滋防治」、「同志家庭」等工作。
除了原本的青少年同志外，熱線的服務對象也擴大至同志的父母、老年同志等。2003年4月，成立「家庭小組」，以提供同志父母資源與協助為目標，並於同年12月與心靈工坊出版社合作，出版《親愛的爸媽，我是同志》一書，記錄七位母親與一位父親，在面臨子女出櫃後的心路歷程，讓其他同志的父母有管道了解同志親子議題。此書出版後，蟬聯同志專門書店「晶晶書庫」的推薦好書。
2006年，熱線與這一群同志父母，更進一步成立了「櫃父母同心協會」，櫃父母取自「同志出櫃，父母即入櫃」之意，該協會由同志父母組成，將為同志子女爭取更多平等的權利。熱線老年同志工作小組係與邊緣同志口述歷史小組有關，主要訪談北部老年男同志，並將針對臺灣老年福利政策提出同志團體的觀點，與公、私部門進行對話。
關於同志人權問題，熱線都會就相關法案進行研究，並不定期舉辦人權教育座談會，聲援同志侵權事件，並提供相關法律諮詢服務。熱線也曾主辦或協辦臺北同玩節、同志大遊行等大型同志活動，另與性別人權協會、中華民國感染者權益促進會、日日春互助關懷協會、TG蝶園等保持合作，連結弱勢團體，相挺串連。
2004年，「性別平等教育法」通過，讓熱線得以進入校園，為教師們舉辦「認識同志研習營」，介紹同志議題與推廣性別概念教育，讓同志學生不再孤單！同時，發起各式促進友善校園的活動，如教師節的「一人一信給老師」活動，讓身處教育體系中的老師，能看見同志的真實處境。
熱線健康與愛滋小組，則運用同志觀點與大家討論性安全與性愉悅議題，讓同志朋友瞭解在性愛過程中怎麼保護自己與另一半，並出版《男同志性愛達人》手冊，成立女同志之拉子健康小組。
